Asociacion Regional de Dialisis y Trasplantes Renales de Capital Federal y Provincia de Buenos Aires
Direccion: Gascon 88 C1181ABB Telefono: 011-5530-8900 (rotativo) FAX: 011-5530-8901
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Rev. Nefrol. Diál. y Transpl., N° 57 - Septiembre / Diciembre de 2002, Pág. 15-26
Nuevas terapias en el tratamiento de la insuficiencia renal aguda y crónica. El riñón artificial.
José Luis González Salazar
Se. Ne. MI.-RTS Servicio de Nefrología y Medio Interno - Pilar - Buenos Aires - Argentina
INTRODUCCION
A pesar de los avances en las distintas terapias de depuración extracorpórea y el mayor desarrollo tecnológico en los cuidados intensivos, la mortalidad de la insuficiencia renal aguda no ha mejorado.(8)(14) La sustitución de la función renal con hemodiálisis o hemofiltración se realiza a través de una membrana inanimada, estos procedimientos pueden mantener a los pacientes con vida pero con resultados que no pueden ser considerados como óptimos. La mortalidad de la insuficiencia renal aguda sigue siendo alrededor del 50% (12) y la expectativa de vida a los 5 años en un paciente de 50 a 54 años de edad en tratamiento con hemodiálisis crónica es de 47%; estas cifras reflejarían que estos procedimientos no son completos ni fisiológicos(8) y sólo substituyen el clearance de pequeños solutos, mantienendo el balance hidroelectrolítico y la excreción de algunas toxinas urémicas. En cambio, la pérdida de las otras funciones del riñón tales como las de transporte, metabólicas y endocrinas no son reemplazadas por estos tratamientos, ya que son llevadas a cabo por las células tubulares. Estas múltiples funciones del túbulo no pueden ser realizadas por las membranas usadas para la hemodiálisis o hemofiltración, esto requeriría el uso de membranas naturales biológicas que contengan el epitelio de las células tubulares renales.(2) El reemplazo de estas funciones podría mejorar la sobrevida de estas enfermedades. (12)
La construcción del túbulo renal artificial se pudo realizar debido a la conjunción de tres hechos fundamentales:
1) Reconocimiento de la capacidad de las células tubulares para regenerarse después de una necrosis tubular aguda.
2) Participación de distintos factores de crecimiento en esta regeneración.
3) Avances en los cultivos tridimensionales de células in Vitro a partir de investigaciones llevadas a cabo por la NASA con el desarrollo del biorreactor.
Regeneración de las células tubulares en la necrosis tubular aguda
Las células del túbulo proximal son cúbicas o cilíndricas, con núcleo basófilo central, en el polo apical se encuentra la membrana plegada, formando el ribete en cepillo, lo que da una mayor superficie de contacto con el ultrafiltrado, aumentando cincuenta veces la superficie de absorción. El citoplasma contiene un rico aparato de Golgi, lisosomas, ribosomas que contienen RNA y miles de mitocondrias; el túbulo proximal tiene diez veces más mitocondrias que el distal, lo que evidencia una participación metabólica mucho mas importante.(40)
La base fisiopatológica de la necrosis tubular aguda es predominantemente la injuria de la célula tubular que es dañada por procesos tóxicos o isquémicos produciendo detritos celulares que obstruyen los túbulos y precipitan la insuficiencia renal.
En algunos casos cuando estos pacientes son sometidos a diálisis entre los 7 y 14 días pueden recuperar completamente la función renal.(1) A partir de esta observación se puede concluir que la recuperación depende de la regeneración de las células tubulares para restaurar la continuidad y función normal del epitelio tubular, así como de la capacidad de eliminación de los restos necróticos y cilindros intratubulares.
Participación de los factores de crecimiento en la regeneración tubular
Desde el momento que se produce la injuria de la célula tubular los mecanismos de reparación comienzan a actuar, los factores de crecimiento participan para que comience dicho proceso de reparación; no se han encontrado factores de crecimiento específicos para riñón. (1)
Algunos de los factores de crecimiento hallados fueron: Factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento insulina-like (IGF-1), factor de crecimiento tumoral alfa y beta (TGF-alfa) (TGF-beta) y factor de crecimiento hepatocitito (HGF), los cuales actúan localmente y aparecen inmediatamente luego de la injuria. Los receptores a estos factores de crecimiento se hallaron en las células epiteliales renales, en el intersticio medular y en los glomérulos. Se ha propuesto la administración de factores de crecimiento para acelerar la recuperación de la falla renal (26), y se han hecho ensayos experimentales y clínicos que han demostrado beneficios. (23)
El factor de crecimiento epidérmico (EGF) administrado exógenamente en ratas luego de 30 minutos de clampeo bilateral de las arterias renales seguida de reperfusión mostró que aceleraba los procesos de regeneración tubular comparado con el grupo control; observándose aumento de la incorporación de timidina en el riñón para la síntesis de ADN. (17)
El factor de crecimiento hepatocitito (HGF) posee una gran potencia mitógena en el proceso de maduración de los hepatocitos, además tiene una actividad mitogénica sobre las células tubulares renales.(18) Durante la embriogenesis el HGF ayuda a la organogénesis y morfogénesis de varios tejidos y órganos como hígado, riñón, pulmón, intestino, glándula mamaria, dientes y esqueleto. En el adulto el HGF posee funciones organotrópicas y de regeneración en hígado, riñón y pulmón; en el cerebro es un factor neurotrópico; en el tejido neoplásico está involucrado en la invasión y metástasis.(21) Se han encontrado receptores para HGF en las células tubulares. (19)
La administración del factor de crecimiento insulina-like 1 (IGF-1) disminuyó el grado de insuficiencia renal y el tiempo de recuperación. (20)
De las células tubulares exfoliadas y encontradas en orina se aisló el ácido lisofosfatídico (LPA) que es generado en la membrana celular de las células injuriadas y actúa como un mediador intracelular de varios procesos biológicos como inflamación, proliferación y reparación. Se aislaron estas células exfoliadas del túbulo proximal y se comprobó su efecto mitogénico ya que al agregarlo a un cultivo de células tubulares aumentaron la síntesis de DNA un 23,5% y el número de células un 86,6%. (27)
Los factores de crecimiento inducen una proliferación celular, migración y modulan la expresión de varias proteínas. (24)
Hay otros factores que inhiben la tubulogénesis como por ejemplo la Activin A un miembro de la familia de TGF-beta, la administración de antagonistas de la Activin A promueve la regeneración tubular en los modelos de isquemia-reperfusión. (25)
Las células tubulares poseen la capacidad de diferenciarse morfológicamente y desarrollarse tridimensionalmente en estructuras tubulares, además poseen la habilidad de autorenovarse in Vitro como expansión clonal de una sola célula. (22)
Cultivo de células in Vitro y desarrollo del Biorreactor
A principio del siglo veinte Harrison y Carrie realizaron las primeras investigaciones sobre el cultivo de células vivas. Uno de las limitantes en el desarrollo de esta tecnología fue mantener estos cultivos estériles, esto se pudo mejorar con la incorporación de antibióticos a los cultivos celulares. Durante mucho tiempo la forma de cultivar células in Vitro fue hacerlo en placas en forma plana, sembradas con medios nutritivos, formando una lámina uniforme bidimensional de células, o en suspensiones de células libres en el medio nutritivo siempre bajo la influencia de la gravedad. (28)
En los últimos años se han podido realizar cultivos celulares tridimensionales, mediante la ingeniería de tejidos que desarrollan células y tejidos; aspirando en el futuro poder desarrollar órganos completos in Vitro. (29)(30)
Esto pudo realizarse y aplicarse gracias a los trabajos realizados en el espacio por científicos de la NASA quienes desarrollaron el denominado Biorreactor HARV (High-Aspect Ratio Vessel), a partir del año 1990 la NASA otorgó la licencia de comercialización exclusiva para uso científico a la empresa Syntecon, Inc. (32)(31)
Las células vivas aisladas de tejidos son suspendidas en un medio nutritivo dentro del reactor, el cual está provisto de un sistema de intercambio de gases que funciona como una membrana alveolar entregando oxigeno disuelto y removiendo dióxido de carbono. Los nutrientes son perfundidos en el cultivo y renovados continuamente, los desechos metabólicos son removidos. Los cultivos son mantenidos a pequeñas velocidades de rotación para obtener un valor de gravedad cero, de esta manera las células se orientan tridimensionalmente respecto a las demás simulando las relaciones de continuidad que tenían en el tejido de origen. Por otra parte ha sido muy importante la incorporación dentro del biorreactor de soportes para células a partir de polímeros como el ácido poliglicólico fibroso (PGA) y la pronectina -L, que favorecen el adosamiento tridimensional de las células y luego se degradan a medida que el tejido aumenta de tamaño. (33)
Desarrollo del túbulo bioartificial
En 1986 se comenzaron los estudios de cultivo de células renales y un sistema híbrido bioartificial,(4) se desarrollaron dispositivos de ultrafiltración a través de fibras semipermeables cubiertas con células renales epiteliales y se probaron dos líneas celulares epiteliales MDCK (célula tubular distal) y LLC-PK1 (célula tubular proximal) y con dos diferentes membranas una de copolímero acrílico y otra de polisulfona y se comprobó que las células sembradas alcanzaron su desarrollo en tres semanas y que adoptaban distinta morfología de acuerdo al tipo de polímero utilizado.(5)
Se han realizado cultivos de estas células tubulares MDCK y LLC-PK1 en microporos de membranas de nitrato de celulosa y se estudiaron en cámara de difusión para comprobar su permeabilidad; encontrando que la inulina, glucosa y paraaminohipurato se movilizaban a través de las membranas celulósicas con similares tasas en cada dirección, equilibrándose ambos compartimentos en menos de doce horas; las membranas sembradas con células MDCK (distales) fueron impermeables a los tres solutos, en cambio las LLC-PK1 (proximales) fueron impermeables a la inulina y el paraaminohipurato, pero demostraron un flujo neto apical-basal de glucosa. Comparándolo con el riñón normal la capacidad de estas células de reabsorber glucosa fue del 20%. (6) A su vez se comprobó que las células LLC-PK1 eran capaces de remover Beta 2 microglobulina(7) y de responder a estímulos osmóticos y oncóticos, (13) permitiendo el pasaje de agua y sodio sin dejar pasar toxinas urémicas como urea y creatinina. (16)
Se han analizado la viabilidad de estas células al aplicar presión transmembrana (PTM) y controlar el transporte convectivo de agua, la aplicación de PTM positiva en el lado basal produjo filtración, llegando a un estado de equilibrio luego de 60 minutos, en cambio al aplicar PTM del lado apical no hubo pasaje de agua; estudios morfológicos de los cultivos realizados luego de la aplicación de PTM demostraron la ruptura de las uniones estrechas; estos resultados demostrarían la posibilidad de aplicar PTM basolateral para poder controlar el flujo de agua en el túbulo bioartificial. (9)
Faltaba saber como reaccionarían estos cultivos celulares al estar en contacto con plasma urémico, para ello se investigó el trasporte transepitelial de inulina, glucosa y tetraetilamonio en un medio estándar y con el hemofiltrado obtenido de pacientes urémicos. La inulina no fue reabsorbida en ninguno de los dos medios, el tetraetilamonio fue secretado mas en el medio urémico y la reabsorción de glucosa fue igual para los dos, estos resultados muestran que estas células mantienen sus características de reabsorción y secreción en condiciones urémicas. (11)
En los riñones adultos de mamíferos hay un pool de células progenitoras que después de la injuria comienzan a repoblar el nefrón a delinear la membrana basal y formar un túbulo funcionante. Usando estas células progenitoras se pudo desarrollar el túbulo bioartificial.
Construcción del Túbulo Bioartificial
Las experiencias mas importantes están siendo llevadas a cabo por David H. Humes y colaboradores en la Universidad de Michigan, Ann Arbor USA, ellos han podido desarrollar el denominado RAD (bioartificial renal tubule assist device) (11) , basándose en la posibilidad de aislar y cultivar las células tubulares progenitoras, y la habilidad que poseen éstas de autoregenerarse, diferenciarse y agruparse espacialmente para cumplir sus funciones específicas.
- Fuente de tejido, aislamiento de células y cultivo
Las células progenitoras fueron aisladas de tejido renal de cerdo y éstas fueron expandidas a través de varios pasajes en gel de colágeno de esta manera comienza el crecimiento de distintas poblaciones celulares.
- Construcción del RAD
El soporte para estas células fueron hemofiltros de polisulfona high-flux (Fresenius MR) con una superficie de 97 cm2, el filtro conteniendo 128 fibras capilares de un diámetro interno de 200 micras, las superficie intraluminal fue cubierta con pronectina-L (polímero que favorece la adhesión de las células en la membrana de polisulfona). Se han usado diferentes matrices extracelulares para obtener una mejor fijación celular como los colágenos tipo I y IV, laminina y fibrionectina.(15) La membrana basal de las células tubulares está compuesta en su mayor parte por laminina, esta sustancia agregada al cultivo celular ha demostrado que favoreció su desarrollo y adhesión en las fibras de polisulfona, también ha mostrado buenos resultados el uso de un derivado sintético de la laminina, la pronectina-L. (11)
Estas fibras tienen un tamaño de poro lo suficientemente pequeño para impedir el pasaje de IgG e IgM, de esta manera el polímero podría actuar como una barrera inmunoprotectora pudiendo ser usadas células de distintos mamíferos.
Las células fueron infundidas dentro de los capilares y el dispositivo se conectó al biorreactor para su nutrición y perfusión. Los espacios extracapilares e intracapilares se prefundieron con medios de cultivos. La perfusión se tiene que incrementar paulatinamente y en forma controlada para que las células se adapten a los incrementos de las fuerzas de rozamiento y se evite de esta manera su desprendimiento de las fibras huecas. (11)
Entre los 7 y 10 días de estar en el biorreactor las células se multiplicaron formando una capa de revestimiento de la fibra de polisulfona adoptando la forma que tienen normalmente en el túbulo renal incluyendo el microvello apical, las uniones estrechas y las vesículas endocíticas.
De esta manera las células pudieron ser mantenidas viables hasta por un período de seis meses. La masa celular del túbulo proximal en un riñón es de aproximadamente 5 x 109 células; el número de células que se desarrollaron dentro de un filtro de 0,4 m2 de superficie fue aproximadamente de 1.4 x 109 células. (11)
El tamaño de las fibras donde se implantan las células tiene importancia por que de ello depende la posibilidad de mantener la viabilidad celular por un mayor período de tiempo. Las células necesitan para mantenerse viables y crecer no estar a una distancia mayor de 125 a 200 micras de la fuente de oxígeno, de esta manera pueden permanecer viables en el centro del tejido varias semanas dentro del birreactor.
- Modelos de Túbulo Bioartificial
Se han analizado dos modelos de túbulo artificial (Figura 1), en los dos casos se usaron hemofiltros convencionales para obtener el ultrafiltrado.
Figura 1
El primer diseño (A) consistió en el cultivo de células tubulares proximales a través de aislamiento primario y creciendo en una monocapa de fibras huecas alojadas en un filtro. El ultrafiltrado recogido del hemofiltro fue derivado al espacio intracapilar del dispositivo y la sangre postfiltrada se dirigió al espacio extracapilar. El otro diseño (B) permite una alta densidad celular, las células son cultivadas en un microportador poroso, que son varias esferas formando un rosario colocados en el espacio extracapilar. En este caso el ultrafiltrado puede circular a través de las células en los microportadores en el espacio extracapilar y la sangre circula por dentro de los capilares, supliendo los nutrientes y el aporte de oxígeno mientras mantiene la inmunoaislacion del compartimiento celular.
El oxígeno es el factor limitante para el crecimiento y viabilidad celular. La tasa basal de respiración celular no tuvo diferencias en los dos modelos.(3)
La oxigenación es crítica para mantener la viabilidad celular, mientras que las células se encuentran en el biorreactor la fuente de oxigeno es externa, cuando el túbulo artificial se usa in vivo la única fuente de oxigeno es la que se encuentra disuelto en el ultrafiltrado.
Fisiología del Túbulo Proximal Renal
- Reabsorción de Agua, Sodio, Glucosa y Aminoácidos (34)
Las células tubulares son células epiteliales polarizadas por lo que tienen una diferencia de potencial (ΔP) entre la luz tubular y el intersticio peritubular, esta ΔP es generalmente negativa en la luz, es decir que la membrana apical de la célula está menos polarizada que la basolateral. El Na+ entra en la célula epitelial por la membrana apical a través de canales conductivos para el Na+ , luego es bombeado en la membrana basolateral por la ATPasa Na+/K+.
Existen canales de K+ que sirven para mantener una concentración intracelular estable de este ión, cuando aumentan los niveles intracelulares el K+ sale al intersticio a través de estos canales.
En la membrana luminal de la célula tubular proximal existen intercambiadores Na+ / H+ que permite la entrada de Na+ a la célula generando un gradiente eléctrico que favorece la salida de H+, la baja concentración de Na+ en el interior de la célula es mantenido por la bomba ATPasa Na+/K+ ubicada en la membrana basolateral.
Las 2/3 partes de la reabsorción de Na+ y agua ocurren en el túbulo proximal.
La mayor parte de la reabsorción del agua se hace a través de un mecanismo paracelular. Entre las células tubulares se encuentran espacios intercelulares, el Na+ es transportado activamente hacia este espacio aumentando la osmolaridad esto promueve a su vez por ósmosis el pasaje de agua a través de los canales de agua (Acuosporinas), de esta manera dentro del canal se acumula Na+ y agua, dado que el canal tiene paredes rígidas este aumento del volumen genera un aumento de la presión hidrostática que desplaza el agua a través de la zona mas permeable que es la membrana basolateral lo que produce el pasaje del fluido al capilar peritubular, arrastrando K+ y Ca++ (solvent drag).
En el túbulo proximal se reabsorbe glucosa junto con el Na+ a través de un transportador común que aumenta la afinidad del Na+ para la glucosa y viceversa. Además se reabsorbe mas del 85% del Bicarbonato filtrado y aminoácidos en un cotransporte con el Na+.
Al modificar la composición del líquido tubular introduciéndole una molécula osmoticamente activa (manitol, sucrosa, urea) la reabsorción de Na+ no es seguida por una cantidad equiosmótica de agua, por lo tanto la reabsorción de agua es inhibida cuando el fluido tubular es hiperosmótico.
- Reabsorción de Bicarbonato (34) (35)
La membrana apical secreta H+ a la luz tubular por dos mecanismos:
1) antiporter Na+ / H+ usando el gradiente eléctrico luz-célula sin gasto de energía
2) H+ ATPasa.
El bicarbonato pasa a la sangre peritubular a lo largo de la membrana basolateral también por dos mecanismos:
1) simporter Na+ /CO3H-, por cada molécula de Na+ se absorben 3 de CO3H-.
2) antiporter Cl/CO3H- que intercambia cloro por bicarbonato.
El deterioro de estos mecanismos dan lugar a la acidosis tubular tipo II.
La anhidrasa carbónica ubicada en el ribete en cepillo de la célula tubular proximal permite la reabsorción de bicarbonato, ya que acelera la deshidratación del CO2 y H2O, esta enzima es inhibida por la acetazolamida.
Normalmente existe una autorregulación, el túbulo proximal tiene la capacidad de reabsorber una tasa constante de la carga filtrada (67%) tanto de agua como de solutos, esto es el llamado balance glomérulo-tubular, por lo tanto al aumentar la filtración aumenta la reabsorción tubular y viceversa.
- Reabsorción de Calcio (34)
En el túbulo proximal se reabsorbe el 70% del Ca++ iónico filtrado. El 20% de esta reabsorción se hace a través de la vía transcelular, el Ca++ entra en la célula por gradiente electroquímico, dado que la célula es en su interior eléctricamente negativa con respecto a la membrana apical y esto favorece la entrada de Ca++ , luego es bombeado a través de la membrana basolateral hacia el capilar peritubular por una bomba ATP asa Ca++ / Na+ que intercambia una molécula de Ca++ por 3 de Na+ .
Pero la mayor parte (80%) del Ca++ se reabsorbe por la vía paracelular en forma pasiva arrastrada por agua.
- Reabsorción de Fósforo inorgánico (Pi) (34)
El túbulo proximal reabsorbe el 80% del Pi filtrado. La vía de reabsorción es transcelular. Entra a la célula a través de un cotransporte con Na+ y pasa a través de la membrana basolateral a través de un contratransporte intercambiando aniones o en forma pasiva.
- Reabsorción de glutation (34)
El glutation es un tripéptido, el mas abundante péptido intracelular. Su rol es de antioxidante y juega un papel muy importante en la inmunocompetencia.
El glutation es libremente filtrado, el túbulo proximal regenera la mayor parte de este péptido regulando su homeostasis corporal.
Esta regeneración ocurre por una degradación del glutation iniciada por la gamma glutamiltranspeptidasa en la membrana del borde ribete en sus aminoácidos constituyentes, estos aminoácidos son transportados dentro de las células tubulares donde vuelve a resintetizarse y retorna a la circulación sistémica.
- Secreción tubular de aniones y cationes orgánicos (34)
La secreción tubular tiene como finalidad la eliminación de sustancias exógenas y es uno de los mecanismos por el cual el organismo se desembaraza de drogas, xenobióticos, productos endógenos y fundamentalmente es la forma en que el riñón entrega a los sitios de acción modificadores del transporte como pueden ser prostaglandinas, que son sintetizadas en el intersticio renal y acceden a los sitios de donde tienen acción fisiológica.
El anión orgánico mas estudiado es el Paraminohipurato (PAH) como prototipo de todos los aniones orgánicos. El PAH es secretado activamente por las células del túbulo proximal.
Los aniones orgánicos son transportados desde los capilares peritubulares hacia la luz tubular mediante un proceso de contratransporte de tipo electroneutro: alfacetoglutarato/ Na+ utilizando el gradiente electroquímico favorable para la reabsorción de Na+ desde la luz tubular hacia la célula a través de la membrana luminal. Una vez dentro de la célula el PAH es transferido hacia la luz tubular en contratransporte en general con aniones inorgánicos como el cloro, bicarbonato, lactato, oxalato y citrato). Este transporte a través de la membrana basolateral se inhibe con el Probenecid. Por lo tanto la secreción de aniones orgánicos se hace a través de la célula (vía transcelular) y por lo tanto es importante la permeabilidad de la membrana basolateral como la apical para que este proceso pueda realizarse. Algunos de los Aniones orgánicos secretados por el túbulo proximal son: Penicilina, Sales biliares, Nucleótido cíclicos (AMPc, GMPc), Toxinas urémicas (Fenoles, indoles), Diuréticos, Metabolitos de hormonas (aldosterona, estradiol), Antinflamatorios, Oxalato, Acido úrico, Uratos, Sacarina y Vitaminas.
- Amoniogénesis
La reabsorción de bicarbonato no es suficiente para suplir la pérdida que ocurre durante la titulación de los ácidos no volátiles producidos por el metabolismo, por lo tanto el organismo debe conseguir nuevo bicarbonato, esto se hace a través de la generación de amonio. (34)
La producción renal de amonio es esencial para la eliminación de la carga de ácidos y para el mantenimiento del balance acido-base en el organismo. Por cada molécula de amonio en la orina se recupera una molécula de bicarbonato.
El amonio es producido en las células del túbulo proximal por el metabolismo de la glutamina, que en la mitocondria produce dos moléculas de NH+4 y un anión divalente, cuyo metabolismo ulterior genera dos moléculas de bicarbonato. Esta capacidad de generar amonio responde a las variaciones del pH, en caso de acidosis aumenta la producción de amonio y en alcalosis la disminuye. (35)
Características del Túbulo Bioartificial in Vitro
* Transporte
- Reabsorción de fluidos inhibido por la Ouabaina y por la Sucrosa.
- Reabsorción de Bicarbonato inhibido por la acetazolamida.
- Reabsorción de glucosa, inhibida por la phloridzina.
- Reabsorción de glutation.
- Transporte de PAH inhibido por el probenecid.
* Metabólico
- Amoniogenesis en respuesta al pH.
- Gluconeogenesis.
* Endocrino
- Activación de 1,25 DihidroxiVitamina D3.
- Avivación de PTH.
- Inhibición de fosfato.
El túbulo proximal "in vivo" reabsorbe el 50 al 60 % del agua filtrada por los glomérulos, ésta reabsorción es isoosmótica y es regulada por diferencias de presión osmótica y oncótica generadas a través del epitelio de las células tubulares. (34)
In Vitro se ha observado que existe una reabsorción activa de Sodio dependiente de la bomba Na+/K+ ATPasa, que pudo ser inhibida por la ouobaina y también cuando se le adicionó un agente osmótico no reabsorbible como la sucrosa.
La absorción absoluta "in Vitro" observada en el túbulo bioartificial con 1 m2 de superficie fue de 15 ml/min lo que lo hace compatible para el uso clínico. (11)
La reabsorción de bicarbonato también en el dispositivo bioartificial se realizó de manera activa y fue inhibido por la acetazolamida, lo que demostró la participación de la anhidrasa carbónica.
También se observó reabsorción activa de glucosa que fue inhibida con la administración de phlorizin que es un inhibidor del transportador Na+ / glucosa.
Para comprobar la secreción tubular de cationes orgánicos se agregó PAH, las células tubulares in Vitro tuvieron una alta tasa de secreción (30 ug/min) y fue inhibida por el probenecid.
El glutation se reabsorbió un 50% en un solo pasaje por el túbulo bioartificial, esta reabsorción fue bloqueada con el agregado de Acivicin que es un inhibidor selectivo e irreversible de la gama-glutamiltranspeptidasa.
Las células del túbulo bioartificial demostraron una alta capacidad de generar amonio y tuvieron respuesta a las variaciones del pH, aumentando la amoniogénesis en respuesta a la acidosis.
Al testear la función endocrina y metabólica se evidenciaron altas tasas de hidroxilacion de 25 vitamina D3 además se observó un control fisiológico entre las relaciones de PTH y fosfato.
Características del Túbulo Bioartificial in Vivo
Recientemente Humes y col.(2) analizaron por primera vez el desempeño del túbulo bioartificial "in vivo" usando perros urémicos nefrectomizados. Las células tubulares fueron obtenidas de riñón porcino, sembradas e infundidas dentro de filtros de polisulfona high-flux con superficies
de 0,4 y 0,7 m2 y conectadas a un biorreactor. Los perros fueron conectados a un circuito de circulación extracorpórea (Figura 2)
Figura 2
El riñón bioartificial consistió en un filtro de polisulfona de 0,7 m2, el usado habitualmente para hemofiltración conectado en serie con el RAD. Se lavó previamente el circuito con solución de ringer heparinizada. El flujo de sangre se mantuvo con bomba peristáltica, el ultrafiltrado obtenido fue reservado en una bolsa e infundido a 5,7 ml/min en el compartimiento intraluminal del RAD, la sangre ultrafiltrada es infundida dentro del compartimiento extraluminal del RAD. La sangre retornaba al animal a través de otra bomba peristáltica que fue necesario colocar para mantener la presión hidráulica dentro del RAD. Durante el procedimiento se realizó heparinización continua del circuito y se mantuvo la temperatura entre 36C° y 38C°.
El fluído removido (orina) fue monitoreado continuamente y remplazado en forma similar a una hemofiltración convencional.
Para poder evaluar la capacidad de transporte y metabolismo de estas células tubulares in vivo se tomaron muestras de sangre y ultrafiltrado fueron obtenidas de 5 puntos del circuito cada hora. En las muestras fueron medidos: sodio, potasio, cloro, Co2 total, glucosa, urea, nitrógeno, creatinina, calcio, fósforo, proteínas totales, albúmina, amonio, glutation, y 1,25 dihidroxi-vitamina D3, también se monitorearon el volumen del ultrafiltrado procesado por el RAD, y las tasas de ultrafiltración.
Características de transporte observadas en el RAD in vivo (2)
El túbulo proximal in vivo reabsorbió aproximadamente 40 a 50% del Sodio y el agua filtrada, la reabsorción del fluído en el túbulo proximal es isoosmótico y el sodio lo hace en forma activa. En el RAD la reabsorción de sodio y agua fue similar al nefrón vivo; la relación entre el fluido tubular (TF) y el ultrafiltrado (UF) para el sodio (TF:UF) Na fue de 1, las sustancias que tengan una relación TF:UF menor a 1 evidencian que hay un impulso del soluto a través del epitelio por encima del transporte del fluido, lo que sugiere un transporte activo esto es lo que sucede para el potasio, bicarbonato y glucosa.
Desempeño metabólico observado en el RAD in vivo
Para evaluar el comportamiento del RAD in vivo como reemplazo de la función renal se evaluaron tres parámetros metabólicos: la excreción de amonio, la regeneración de amonio y la producción de 1,25 dihidroxi vitamina D3.
- Amonio
La amoniogénesis es un importante proceso metabólico del túbulo, la mayor parte del nitrógeno derivado del catabolismo proteico es excretado en forma de urea, 10 a 15% del nitrógeno es eliminado a través de la vía de la amoniogénesis. Otro rol del amonio es excretar la carga de ácido actuando como un buffer intraluminal para la secreción y excreción de protones. (34) (35)
En las células del RAD se observaron altos niveles de excreción de amonio correlacionándose con los cambios de pH del fluido de entrada y la mayor acidificación a la salida.
- Glutation
En el RAD se evidenció una reabsorción fraccional del 60%.
- Vitamina D
La mas activa es la 1,25 dihidroxi vitamina D3 (1,25-[OH]2D3), la enzima responsable de la conversión de 25-OH-D3 a 1,25-(OH)2D3 es la 25-(OH)D3 -12 hidroxilasa, la cual es una citocromo P-450 monoxigenasa, esta enzima se encuentra en el interior de la membrana mitocondrial de las células tubulares proximales.
El tratamiento con RAD durante 24 horas en forma continua mostró un aumento significativo de los niveles plasmáticos de 1,25 dihidroxi vitamina D3.
Uso del Túbulo Bioartificial en la insuficiencia renal aguda
En la actualidad la insuficiencia renal en los pacientes internados en las unidades de cuidados intensivos forma parte de un compromiso multiorgánico y está frecuentemente asociado a sepsis. (36)
Según el estudio de Kanus(37) la mortalidad del fallo multiorgánico alcanza a 7 días el 46% con falla de dos órganos y el 100% con falla de tres órganos. Por lo tanto estos pacientes mueren a pesar de tener las cifras de urea y creatinina bajas.
Las células tubulares podrían tener un valor adicional para este tipo de procesos, los tratamientos convencionales se basan en la filtración y excreción, pero no se considera la capacidad metabólica y endocrina del riñón.
Rol del túbulo proximal en la defensa del huésped
En la sepsis hay una lesión de las defensas del huésped que puede ser muy dependiente de la actividad barredora de los radicales libres de oxígenos (scavenger), este deterioro puede estar relacionado a la síntesis de citoquinas y los factores de crecimiento. Se ha comprobado la capacidad de las células tubulares de metabolizar y sintetizar citoquinas, glutation, scavenger de radicales libres. (2)
Los niveles disminuidos del glutation en la insuficiencia renal podrían ser mejorados con el túbulo artificial, esto puede realizarse por la capacidad de reducir los radicales libres de oxígeno producidos durante la sepsis. La normalización de los niveles de vitamina D puede ayudar a normalizar la actividad inmunológica, las células citotóxicas T y otros tipos de células inmunológicas que son activadas son un órgano efector final de la vitamina D. La producción de citoquinas en la sepsis es muy alta e induce colapso vascular, isquemia y fallo multiorgánico.
- Rol de la Interleukina-10 (IL-10)
Las células tubulares pueden influenciar las vías de las citoquinas en la sepsis. La IL-10 es muy importante en el evento séptico y en la mortalidad de la sepsis. La IL-10 es un importante inhibidor de la respuesta inmune mediada por células. (1)(38)
Las células Th1 responden exageradamente en la sepsis y producen Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), IL-6 y gamma interferón, produciendo óxido nítrico, vasodilatación y colapso vascular. La IL-10 también deja fuera de funcionamiento a la producción de macrófagos y neutrófilos de estos tipos de quimoquinas teniendo una actividad antinflamatoria.
Se ha observado en modelos animales de shock por endotoxinas que los niveles de IL-10 aumentadas disminuyen la mortalidad y viceversa.
Los túbulos artificiales pueden inducir la producción de IL-10. Se han analizado la producción de IL-10, en ambientes controlados no secretan IL-10, pero bajo estrés de endotoxinas hay un gran aumento de su producción.
Esto sugiere que el riñón puede ser muy importante para mantener las defensas inmunológicas, especialmente bajo condiciones de estrés séptico. Quizás esa capacidad metabólica está perdida en la insuficiencia renal ya que las células tubulares se encuentran dañadas, por lo que habría una carencia metabólica del riñón.
Experiencia del uso del túbulo bioartificial en humanos (39)
En la actualidad se está llevando a cabo un protocolo de investigación del uso del RAD en humanos en la Universidad de Michigan, Ann Arbor por H. Davd Humes y colaboradores. (39)
El primer tratamiento usando este dispositivo en humanos fue llevado a cabo el 15 de Marzo del 2001.
El objetivo primario de este estudio será evaluar la sobrevida durante el tratamiento y a los 30 dias, y los objetivos secundarios serán el análisis de los cambios de tensión arterial, índice cardiaco, presión capilar pulmunar y resistencia vascular sistémica; evaluación del impacto del RAD en la función renal durante el tratamiento y por último analizar la actividad metabólica medida por el metabolismo del glutation y la hidroxilación de la viamina D3.
Los criterios de inclusión en el protocolo son: diagnóstico clínico de NTA, requerimiento de reemplazo continuo de la función renal, con medición de tensión arterial media y presiones pulmonares con catéter de Swan-Ganz, ser mayores de 18 años y mortalidad predictiva por Apache III entre 50% y 80%. Son excluídos los pacientes con contraindicación de anticoagulación sistémica, administración de aminoglucosidos dentro de las 48 horas, embarazo, falla hepática, sospecha de daño cerebral irreversible y orden de no reanimación.
Las células tubulares fueron obtenidas del descarte de riñones humanos donados. El RAD fue fabricado con un filtro Fresenius de polisulfona high flux (F-40) de 0.7 m2 de superficie. Como matriz se usó laminina murina o colágeno tipo IV bovino.
La disposición del circuito fue la anteriormente descripta (Figura 2), la hemofiltración fue venovenosa y realizadas con filtros de polisulfona F40 en máquinas Gambro AK-10. La solución de reposición fue la convencional.
El flujo sanguíneo de salida del hemofiltro fue bombeado a 80 ml/min dentro del espacio extraluminal del RAD y el ultrafiltrado fue bombeado a una velocidad de 2 a 10 ml/min dentro del espacio capilar del RAD donde se encuentran las células tubulares. Las presiones transmembrana e hidráulicas fueron reguladas para mantener una reabsorción del 50% del ultrafiltrado.
Se han reportado resultados preliminares de 3 pacientes que fueron incluidos en el estudio utilizando el RAD en forma continua durante 24 horas.
En cuanto al metabolismo del glutation se observó una disminución de la eliminación de esta sustancia en el ultrafiltrado final lo que indicaría la actividad metabólica de las células pero esto no mostró ser significativo individualmente.
Se evidenciaron también aumento del dosaje de vitamina D3. No se observó neutropenia, ni hipoglucemias. El desprendimiento de células tubulares medidas en el ultrafiltrado fue mayor durante la primer hora como ocurrió en los ensayos llevados a cabo en animales.
Hasta el momento los datos indican que los dispositivos son viables y funcionales.
CONCLUSIONES
La mortalidad de la insuficiencia renal aguda sigue siendo elevada a pesar de haber mejorado la tecnología en la circulación extracorpórea y el uso de membranas sintéticas mas biocompatibles. Los avances en las unidades de cuidado intensivo han permitido mantener con vida a pacientes en estado crítico y la insuficiencia renal aguda ha pasado a formar parte de un fallo multiorgánico donde la hemodiálisis en muchos casos se hace imposible debido a la inestabilidad hemodinámica de estos pacientes, pasando a tener relevancia la depuración extracorpórea a través de las denominadas terapias lentas continuas, pudiendo no solo remover pequeñas moléculas sino intermediarios proinflamatorios involucrados en el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), responsable de la falla multiorgánica.
Todas estas terapéuticas se basan en la filtración de diferentes sustancias con distintos pesos moleculares, pero el riñón tiene otras funciones llevadas a cabo por las células tubulares que no son remplazadas, como la reabsorción y secreción tubular, la generación de amonio y la hidroxilación de la vitamina D3.
La construcción del túbulo bioartificial es esencialmente el desarrollo de una membrana "viva" que permite realizar estas funciones.
Se ha podido aislar las células tubulares, cultivarlas en forma tridemensional, implantarlas en membranas sintéticas y estudiar su funcionamiento in Vitro, en animales y actualmente en humanos.
También se están llevado a cabo investigaciones sobre hemofiltros bioartificiales implantables para los pacientes con insuficiencia renal crónica. (1)
Quedan por el momento algunas dudas sobre la utilidad de este tratamiento:
1) Dado que los flujos sanguíneos usados para estos procedimientos son bajos (80 ml/min) no son grandes los volúmenes ultrafiltrados probablemente la remoción de pequeñas moléculas se vea afectada y la filtración sea insuficiente, mas teniendo en cuenta el estado de hipercatabolismo en la que se encuentran estos pacientes. Probablemente en muchos casos habrá que tener dos circuitos con dos accesos vasculares diferentes, uno para la hemofiltración y otro para el túbulo bioartificial.
2) ¿La generación de amonio por parte de estas células ayudarán realmente a estabilizar el equilibrio ácido-base con la consiguiente mejoría hemodinámica?.
3) ¿La recuperación del glutation y el aumento de la hidroxilación de la vitamina D3 serán beneficiosa clínicamente en este tipo de pacientes?.
4) ¿El efecto del RAD sobre las citoquinas tendrá alguna ventaja sobre la hemofiltración convencional o la plasmaféresis?.
Estudios como los que se están llevando a cabo podrán en el futuro descubrir si realmente estos dispositivos mejorarán la mortalidad de la insuficiencia renal aguda.
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